饱和硫酸铵沉淀法步骤

硫酸铵沉淀法的原理及步骤？

硫酸铵沉淀法的原理及步骤？

抗体的纯化 ( 硫酸铵沉淀法）
一， 基本原理
硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
二， 试剂及仪器
1 . 组织培养上清液、血清样品或腹水等
2. 硫酸铵（ NH 4 ） SO 4
3. 饱和硫酸铵溶液（ SAS ）
4. 蒸馏水
5. PBS( 含 0.2g /L 叠氮钠 )
6. 透析袋
7. 超速离心机
8. pH 计
9. 磁力搅拌器
三， 操作步骤
以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸 铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为 33% — 50% 。
（一）配制饱和硫酸铵溶液（ SAS ）
1.将 767g （ NH 4 ） 2 SO 4 边搅拌边慢慢加到 1 升 蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。此即饱和度为 100% 的硫酸铵溶液（ 4.1 mol/L, 25 ° C ）.
2.其它不同饱和度铵溶液的配制
（二）沉淀
1.样品（如腹水） 20 000 ′ g 离心 30 min ，除去细胞碎片；
2.保留上清液并测量体积；
3.边搅拌边慢慢加入等体积的 SAS 到上清液中，终浓度为 1 ： 1 （
4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或搅拌过夜（ 4 ° C ），使蛋白质充分沉淀。
（三）透析
1.蛋白质溶液 10 000 ′ g 离心 30 min （ 4 ° C ）。弃上清保留沉淀；
2.将沉淀溶于少量（ 10-20ml ） PBS -0.2g /L 叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对
PBS -0.2g /L 叠氮钠透析 24-48 小时（ 4 ° C ），每隔 3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；
3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。
四，应用提示
（一） 先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。
1.边搅拌边慢慢加 SAS 到样品溶液中，使浓度为 0.5:1 (v/v) ；
2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时 或过夜（ 4 ° C ）；3.3000 ′ g 离心 30 min （ 4 ° C ），保留上清液；上清液再加 SAS 到 0.5:1(v/v) ，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于 PBS ，同前透析，除去硫酸氨；
4.上清液再加 SAS 到 0.5:1 (v/v) ，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于 PBS ，同前透析，除去硫酸氨；
5.杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效
（二）为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表 1 ）；硫酸氨沉淀法与层析 技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。